Genotoksisite gerektiren biyouyumluluk testleri için, ürün türünüze ve veri ihtiyaçlarınıza bağlı olarak Ames Mutajenite, Kromozomal Sapma, Fare Lenfoma ve Fare Mikronükleus dahil olmak üzere birden fazla test türü sunuyoruz. Bu testler, genotoksisite için in vitro testlerin üç seviyesinden biri olarak OECD ve ISO yönergelerine uygundur.
Uygulanabilir Standartlar
- AAMI / ANSI / ISO 10993-3
- OECD 471, OECD 473
- ASTM E1687
- ANSI / AAMI / ISO 10993-12
Ames Mutajenite Testi
Ames Mutajenite testi, bir tıbbi cihaz/malzemeden elde edilen bir özütün potansiyel mutajenik aktivitesini belirlemek için kullanılır. Bakteriyel Ters Mutasyon Testi (Ames testi), bir tıbbi cihazdan/materyalden gelen sızıntıların mutajenik olup olmadığını belirlemek için genotoksisite testleri dizisinin bir parçası olarak gerçekleştirilir.
Kromozomal sapma
Kromozomal Sapma testi, Çin Hamsteri Yumurtalık (CHO) hücrelerinde yapısal kromozomal sapmalara neden olup olmadıklarını belirlemek için tıbbi cihazları/malzemeleri taramak için kullanılır. Test, kalıcı hasta teması, uzun süreli hasta teması veya kan teması olan cihaz/malzemelerde gerçekleştirilir. Kromozomal Sapma testi, genotoksisite için in vitro testlerin üç seviyesinden biri olarak OECD ve ISO yönergelerine uygundur .
Fare Lenfoma Testi
Fare Lenfoma testi, gen mutasyonlarını, kromozom yapısı ve sayısındaki değişimi ve tıbbi cihazların, materyalin veya bunların ekstraktlarının neden olduğu diğer gen toksisitelerini belirlemek için genellikle memeli hücre kültürlerini kullanır. Bu testler, vücutla uzun süreli teması olan cihazların, kanser potansiyeli olan gen mutasyonlarına neden olabilecek genotoksisiteyi ortaya çıkarmamasını sağlamak için kullanılır.
Fare Mikronükleus Testi
Fare Mikronükleus testi, tıbbi bir cihazın yetişkin farelerin kemik iliğinde bulunan olgunlaşmamış polikromatik eritrositlerde mikronükleus oluşumunu indükleme potansiyelini değerlendirmek için kullanılır.
Örnek Özellikler
- GTX110 : Her biri >60 cm2 veya 2 gram olan 4 eksiksiz cihaz
- GTX150 : 10 mL
- GTX220 : 4 tam cihaz, her cihaz en az 120 cm2 veya 4 gram olmalıdır
- SCX530 : 2 komple cihaz, her cihaz 120 cm2 veya 4 gram olmalıdır. TAT'ı karşılamak için CSS Onayı gereklidir.
Çalışma Anahattı
Ames Mutajenite
Ames Mutajenite testi, mutasyona duyarlılıklarına göre seçilmiş birkaç Salmonella typhimurium suşunu kullanır, çünkü:
- Bakteri yüzeyini kaplayan lipopolisakkarit bariyerinin kısmi kaybına neden olan ve büyük moleküllere karşı artan geçirgenlikle sonuçlanan bir mutasyona bağlı olarak artan hücre duvarı geçirgenliği (rfa mutasyonu)
- Bakteri hücre sisteminde DNA'daki kusurları kesip onaran, hasar görmüş veya mutasyona uğramış bölümlerin onarılamamasıyla sonuçlanan bir mutasyon (uvrB mutasyonu)
- Hataya açık DNA onarım sistemleri içeren R faktörlü plazmitler (bazı suşlar) ve çok kopyalı bir plazmit (bazı suşlar)
Test edici suşlar ayrıca, histidin üretimini kontrol eden gendeki bir mutasyon nedeniyle büyüme için histidine ihtiyaç duyarlar.
Ames testleri, sadece küçük miktarlarda histidin içeren yumuşak bir agar solüsyonunda test organizması ile test maddesinin bir ekstraktının karıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Histidin, aşılanmış test organizmasının sınırlı sayıda bölünme geçirmesine izin verir, ancak normal büyümeye izin vermek için yetersizdir.
Bununla birlikte, suş bir ters mutasyona uğrarsa (spontan veya test maddesi veya pozitif kontrol materyali tarafından indüklenmiş), organizma artık büyümek için histidine ihtiyaç duymaz ve görünür bir koloni veya revertant üretebilir. Yalnızca histidin geni bölgesindeki test organizmasında meydana gelen mutasyonlar, test organizmasının bir organizmaya ters mutasyon geçirmesine neden olur, bu da artık histidine ihtiyaç duymaz.
Test edici suşlar, çeşitli mutajen türlerini tespit etmek için seçilir. Kullanılan test edici suşlar TA97A, TA98, TA100, TA102 ve TA1535'tir.
Test maddesinin özlerinin, az miktarda histidin ile test organizmasını içeren bir plaka üzerinde lekelendiği bir nokta testi de gerçekleştirilir. Test maddesi agardan yayıldıkça daha seyreltik hale gelir. Bu, test edici suşların bir miktar inhibisyonuna neden olan mutajenlerin saptanmasına izin verir. Testler hem S-9 aktivasyonlu hem de onsuz gerçekleştirilir. S-9 aktivasyon sistemi, memeli karaciğer enzim sistemlerini simüle etmek için tasarlanmıştır ve mutajenik olmayan formlardan metabolik aktivasyona uğrayan maddeleri tespit etmek için kullanılır.
Kromozomal sapma
Kromozomal Sapma tahlili, CHO hücrelerinin test eşyası ekstresine maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. Negatif kontrol olarak tahlile boş bir ekstraksiyon ortamı dahil edilmiştir.
CHO hücreleri 75 cm2 hücre kültürü şişelerine ekilir ve hücre kültürü ortamı + %10 serum ile %40-60 konfluent olana kadar inkübe edilir.
CHO hücreleri, bir metabolik aktivasyon sisteminin varlığında ve yokluğunda test eşyası özüne maruz bırakılır. Metabolik aktivasyon sistemi, S9 homojenat, izositrat ve NADP'nin bir karışımıdır. Kullanılan pozitif kontroller, metabolik aktivasyonlu Siklofosfamid ve metabolik aktivasyonsuz Mitomisin C'dir.
Hücre hasatından önce hücreler sitotoksisite açısından incelenir. Şişeler, AAMI/ANSI/ISO 10993-5 ve USP <87>'ye göre 0 – 4 nispi bir ölçekte ayırt edilebilir morfolojik sitotoksisite derecesine göre puanlanır. Üç şişeden elde edilen sonuçların ortalaması alınarak nihai bir sitotoksisite puanı verilir.
Maruziyet ve ekspresyon periyodlarının sonunda hücreler kolsemid ile metafazda tutuklanır. Hücreler daha sonra şişelerden çıkarılır ve hipotonik bir solüsyon ve fiksatif ile muamele edilir. Hücreler mikroskop lamlarına bırakılır. Kromozomlar Giemsa boyası ile boyanır ve Permount® ile kapatılır. Hücreler daha sonra kromozomal anormallikler için mikroskobik olarak incelenir.
Fare lenfoması
Biyouyumluluk Genotoksisite testinde, bir test materyalinin kültürlenmiş bir memeli hücre hattında nokta mutasyonları veya klastojenik (kromozomal kırılma) olayları indükleme kapasitesine sahip olup olmadığını belirlemek için fare lenfoma hücreleri kullanılır. Bu durumda hedef gen, timidin kinaz (TK), dağıtılabilir bir gendir. TK aktivitesinin kaybı, bir mutasyonun meydana geldiğini gösterir. TK, DNA metabolizmasından türetilen timidin için bir kurtarma yolunda yer aldığından, hücreler timidin de novo sentezleyebilir. Bu nedenle, TK'nin kaybı hücreyi yaşayamaz hale getirmez.
Mutantlar seçilebilir ve mutant frekansları, test malzemesine maruz bırakıldıktan sonra hücrelerin kültür ortamına bir timidin analoğunun (triflorotimidin veya TFT) dahil edilmesiyle türetilebilir. Bozulmamış TK'ye sahip normal hücreler analogu içerir ve ölür; mutant hücreler (TK aktivitesinden yoksun) hayatta kalır, koloniler oluşturur ve nicelenir.
Fare mikroçekirdeği
Fare Mikronükleus testinde, polar ve polar olmayan bir ortamda tıbbi bir cihaz çıkarılır. Test makalesi özü pozitif kontroller ve negatif kontroller, hem erkek hem de dişi farelerde 20 mL/kg'da uygulanır. Daha sonra doz uygulamasından 24 ve 48 saat sonra kemik iliği toplanır ve mikroçekirdekli polikromatik eritrositlerin (PCE'ler) varlığı açısından incelenir. PCE'lerin varlığı, cihazdan sızan mutajenik maddenin bir göstergesidir.
Genotoksisite Gerektiren Biyouyumluluk Testleri söz konusu olduğunda Science by EUROLAB, 25 yılı aşkın endüstriyel laboratuvar tecrübesi, uzman ekibi ve son teknoloji araçları ile sizlere en iyi hizmeti sunmayı taahhüt eder.
